RP-HPLC法测定板蓝根、大青叶中靛蓝、靛玉红的含量
作者：孙立新 唐虹 尹萍 宁黎丽 毕开顺
单位：孙立新(沈阳药科大学药学系，沈阳 110015)；唐虹(辽宁卫生职工医学院，沈阳 110015)
关键词：板蓝根；大青叶；靛蓝；靛玉红；高效液相色谱法
沈阳药科大学学报000312 摘 要 用RP-HPLC以安宫黄体酮为内标物同时测定板蓝根、大青叶中靛蓝、靛玉红的含量.色谱条件：色谱柱为Spherisorb C18柱；流动相为甲醇-水(62∶38，V∶V)；检测波长280 nm；靛蓝和靛玉红的平均回收率分别为(99.0±1.1)%和(104.2±3.5)%.本法操作简便，结果准确.
分类号 R914.1
Determination of the Content of Indigo and Indirubin in the Indigowoad Root and Leaves by RP-HPLC
, http://www.100md.com
Sun Lixin,Tang Hong,Yin Ping,Ning Lili,Bi Kaishun
Department of Pharmacy,Shenyang Pharmaceutical University,Shenyang 110015
Abstract An analytical method for determination of indigo and indirubin in the indigowoad root and leaves by RP-HPLC was developed.The HPLC conditions were as follows:spherisorb C18 column(4.6 mm×250 mm);the mobile phase,methanol-H2O(62∶38，V∶V)；detection wavelength，280 nm；internal standard,medroxyprogesterone acetate.The mean recoveries for the indigo and indirubin were(99.0±1.1)% and(104.2±3.5)%，respectively.The method was simple and accurate.
, 百拇医药
Key words indigowoad root；indigowoad leaves；indigo；indirubin;HPLC
板蓝根为十字花科植物菘蓝(Isatis indigotica Fort.)和爵床科植物马蓝Baphicacanthus cusia(Nees)Bremek.的干燥根〔1〕.大青叶为菘蓝、马蓝和蓼科草本植物蓼蓝(Polygonum tinctorium Ait.)的枝和叶〔2〕.板蓝根和大青叶均具有清热解毒、抗菌消炎、凉血消斑等功效，二者在中药成方中经常配伍入药，如金青感冒颗粒，小儿退热颗粒，复方板蓝根颗粒等.板蓝根和大青叶的有效成份都是靛蓝(indigo)和靛玉红(indirubin)〔3〕.靛玉红对治疗慢性粒细胞白血病有较好疗效.靛蓝、靛玉红的含量测定方法已有氧化滴定法、直接比色测定法、薄层色谱法、双波长分光光度法、反相高效液相色谱法〔4〕.其中反相高效液相色谱法采用外标法定量，对获得操作的重复性来说有其不足之处，本文则采用安宫黄体酮为内标物以内标法定量，结果令人满意.
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1 仪器与材料
日本岛津公司高效液相色谱仪LC-6A系列；LC-6A溶剂输送泵；SPD-6AV紫外-可见分光检测器；LC-R3A数据处理装置；7125 20μL定量进样阀.
对照品安宫黄体酮、靛蓝、靛玉红(中国药品生物制品检定所)；甲醇为色谱纯；氯仿为分析纯；水为重蒸馏水；板蓝根、大青叶样品购于各地药材公司.
2 方法与结果
2.1 分离条件
以甲醇∶水(62∶38，V∶V)为流动相，安宫黄体酮为内标物.靛蓝、安宫黄体酮、靛玉红的保留时间分别为15.8，23.8，31.1 min.靛蓝与内标物的分离度为2.90；靛玉红与内标物的分离度为1.51.
2.2 色谱条件
, 百拇医药
色谱柱：Spherisorb C18柱(4.6 mm×250 mm，10 μm)；流动相：甲醇-水(62∶38，V∶V)；流速：1.0 mL/min；检测波长：280 nm；柱温：室温；进样量：20 μL.
2.3 标准曲线
精密称取靛蓝1.5 mg于50 mL量瓶中，靛玉红2.0 mg于100 mL量瓶中，安宫黄体酮50 mg于25 mL量瓶中，分别用氯仿溶解并稀释至刻度.精密吸取靛蓝标准液0.8、1.6、2.4、3.2、4.0 mL分别于10 mL量瓶中，各加入安宫黄体酮内标液2.0 mL，用氯仿稀释至刻度.精密吸取靛玉红标准液0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL分别于5 mL量瓶中，各加安宫黄体酮内标液1.0 mL，用氯仿稀释至刻度.分别进样20 μL，得色谱图，计算出回归方程.靛蓝回归方程：Y=0.078 8C+0.367 2，r=0.999 9，靛蓝在2.4～12.0 μg/mL范围内呈线性.靛玉红回归方程：Y=0.156 8C-0.103 5，r=0.999 9，靛玉红在1.6～8.0 μg/mL范围内呈线性.其中：Y是靛蓝或靛玉红与安宫黄体酮峰面积之比；C是靛蓝或靛玉红的浓度.
, 百拇医药
2.4 样品测定
精密称取板蓝根或大青叶粗粉8 g置索氏提取器中，加氯仿100 mL，80℃回流8 h，浓缩提取液置10 mL量瓶中，加入内标液2.0 mL，用氯仿稀释至刻度，进样20 μL，得色谱图.由回归方程计算靛蓝、靛玉红的含量，并计算出药材中二成分的含量，样品色谱图及样品测定结果如图1、表1所示.
Tab.1 Content of indigo and indirubin in the idigowoad root and leaf from various origins Sample
Origin
Indigo/μg.g-1
Indirubin/μg.g-1
, http://www.100md.com
Indigowoad Leaf
Sichuan
397.6
153.6
Indigowoad Leaf
Anhui
421.5
863.9
Indigowoad Leaf
Anhui
384.0
164.8
, http://www.100md.com
Indigowoad Leaf
Yunnan
957.4
1 117.7
Indigowoad Root
Anhui
17.5
18.5
Indigowoad Root
Hebei
14.6
24.2
, http://www.100md.com
Indigowoad Root
Hebei
8.3
22.0
Indigowoad Root
Yunnan
5.7
7.5
Indigowoad Root
Guangdong
6.8
0
, http://www.100md.com
Indigowoad Root
Jiangsu
8.5
18.3
Fig.1 Chromatogram of idigowoad root and leaves
A—Indigo；B—Medroxyprogeterone acetate;C—Indirubin
2.5 重复性实验
同时提取四川大青叶(样品1)粗粉4份，按上述方法制备样品液，色谱条件同上，测定，并计算出药材中二成份的含量.靛蓝
=397.4 μg/g,RSD=1.9%；靛玉红=149.7 μg/g，RSD=2.0%.
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2.6 加样回收率测定
精密称取四川大青叶(样品1)粗粉4份，其中一份作为对照，另3份分别加入不同量的靛蓝、靛玉红对照液，按样品液方法操作，计算回收率，结果见表2.
Tab.2 Results of recovery tests Constit-
uentes
Added
/mg
Obs
/mg
Recovery
/%
, 百拇医药
Mean±SD
/%
Indigo
1.200
1.193
99.4
1.200
1.191
99.3
1.500
1.500
100.0
99.0±1.1
, 百拇医药
1.500
1.501
100.1
1.800
1.765
98.0
1.800
1.753
97.4
2.000
2.014
100.7
2.000
, http://www.100md.com
2.009
100.5
Indirubin
2.400
2.460
102.5
104.2±3.5
2.400
2.571
107.1
2.800
3.050
, 百拇医药 109.0
2.800
2.951
105.4
3 讨论 作者试用联苯、萘、苯甲酸苯酯、安宫黄体酮等作为内标物，从分离度和保留时间上看，以安宫黄体酮为宜；避光条件下，24 h内板蓝根、大青叶中靛蓝、靛玉红在氯仿中稳定，时间过长，靛蓝、靛玉红分解，故应保证在24 h内完成实验；作者首次采用内标法，准确地测定了板蓝根、大青叶中靛蓝、靛玉红的含量，结果准确、可靠，重复性好.
参考文献
1 崔熙，李松林，王建新，等.南、北板蓝根的鉴别和氨基酸含量比较分析.中药材，1995，15(5)：17～19
2 乔传卓，崔熙.大青叶类药材的研究概况.中药材，1986，(5)：41
3 仲坚.板蓝根与大青叶在河北固安的生产代用情况与原植物辨别.中药通讯，1959,9(4)：15
4 杨军，王京霞.反相高效液相色谱法测定板蓝根、大青叶中靛蓝、靛玉红的含量.中药新药与临床药理，1996，7(2)：43～44
收稿日期:1999-10-08, 百拇医药
单位：孙立新(沈阳药科大学药学系，沈阳 110015)；唐虹(辽宁卫生职工医学院，沈阳 110015)
关键词：板蓝根；大青叶；靛蓝；靛玉红；高效液相色谱法
沈阳药科大学学报000312 摘 要 用RP-HPLC以安宫黄体酮为内标物同时测定板蓝根、大青叶中靛蓝、靛玉红的含量.色谱条件：色谱柱为Spherisorb C18柱；流动相为甲醇-水(62∶38，V∶V)；检测波长280 nm；靛蓝和靛玉红的平均回收率分别为(99.0±1.1)%和(104.2±3.5)%.本法操作简便，结果准确.
分类号 R914.1
Determination of the Content of Indigo and Indirubin in the Indigowoad Root and Leaves by RP-HPLC
, http://www.100md.com
Sun Lixin,Tang Hong,Yin Ping,Ning Lili,Bi Kaishun
Department of Pharmacy,Shenyang Pharmaceutical University,Shenyang 110015
Abstract An analytical method for determination of indigo and indirubin in the indigowoad root and leaves by RP-HPLC was developed.The HPLC conditions were as follows:spherisorb C18 column(4.6 mm×250 mm);the mobile phase,methanol-H2O(62∶38，V∶V)；detection wavelength，280 nm；internal standard,medroxyprogesterone acetate.The mean recoveries for the indigo and indirubin were(99.0±1.1)% and(104.2±3.5)%，respectively.The method was simple and accurate.
, 百拇医药
Key words indigowoad root；indigowoad leaves；indigo；indirubin;HPLC
板蓝根为十字花科植物菘蓝(Isatis indigotica Fort.)和爵床科植物马蓝Baphicacanthus cusia(Nees)Bremek.的干燥根〔1〕.大青叶为菘蓝、马蓝和蓼科草本植物蓼蓝(Polygonum tinctorium Ait.)的枝和叶〔2〕.板蓝根和大青叶均具有清热解毒、抗菌消炎、凉血消斑等功效，二者在中药成方中经常配伍入药，如金青感冒颗粒，小儿退热颗粒，复方板蓝根颗粒等.板蓝根和大青叶的有效成份都是靛蓝(indigo)和靛玉红(indirubin)〔3〕.靛玉红对治疗慢性粒细胞白血病有较好疗效.靛蓝、靛玉红的含量测定方法已有氧化滴定法、直接比色测定法、薄层色谱法、双波长分光光度法、反相高效液相色谱法〔4〕.其中反相高效液相色谱法采用外标法定量，对获得操作的重复性来说有其不足之处，本文则采用安宫黄体酮为内标物以内标法定量，结果令人满意.
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1 仪器与材料
日本岛津公司高效液相色谱仪LC-6A系列；LC-6A溶剂输送泵；SPD-6AV紫外-可见分光检测器；LC-R3A数据处理装置；7125 20μL定量进样阀.
对照品安宫黄体酮、靛蓝、靛玉红(中国药品生物制品检定所)；甲醇为色谱纯；氯仿为分析纯；水为重蒸馏水；板蓝根、大青叶样品购于各地药材公司.
2 方法与结果
2.1 分离条件
以甲醇∶水(62∶38，V∶V)为流动相，安宫黄体酮为内标物.靛蓝、安宫黄体酮、靛玉红的保留时间分别为15.8，23.8，31.1 min.靛蓝与内标物的分离度为2.90；靛玉红与内标物的分离度为1.51.
2.2 色谱条件
, 百拇医药
色谱柱：Spherisorb C18柱(4.6 mm×250 mm，10 μm)；流动相：甲醇-水(62∶38，V∶V)；流速：1.0 mL/min；检测波长：280 nm；柱温：室温；进样量：20 μL.
2.3 标准曲线
精密称取靛蓝1.5 mg于50 mL量瓶中，靛玉红2.0 mg于100 mL量瓶中，安宫黄体酮50 mg于25 mL量瓶中，分别用氯仿溶解并稀释至刻度.精密吸取靛蓝标准液0.8、1.6、2.4、3.2、4.0 mL分别于10 mL量瓶中，各加入安宫黄体酮内标液2.0 mL，用氯仿稀释至刻度.精密吸取靛玉红标准液0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL分别于5 mL量瓶中，各加安宫黄体酮内标液1.0 mL，用氯仿稀释至刻度.分别进样20 μL，得色谱图，计算出回归方程.靛蓝回归方程：Y=0.078 8C+0.367 2，r=0.999 9，靛蓝在2.4～12.0 μg/mL范围内呈线性.靛玉红回归方程：Y=0.156 8C-0.103 5，r=0.999 9，靛玉红在1.6～8.0 μg/mL范围内呈线性.其中：Y是靛蓝或靛玉红与安宫黄体酮峰面积之比；C是靛蓝或靛玉红的浓度.
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2.4 样品测定
精密称取板蓝根或大青叶粗粉8 g置索氏提取器中，加氯仿100 mL，80℃回流8 h，浓缩提取液置10 mL量瓶中，加入内标液2.0 mL，用氯仿稀释至刻度，进样20 μL，得色谱图.由回归方程计算靛蓝、靛玉红的含量，并计算出药材中二成分的含量，样品色谱图及样品测定结果如图1、表1所示.
Tab.1 Content of indigo and indirubin in the idigowoad root and leaf from various origins Sample
Origin
Indigo/μg.g-1
Indirubin/μg.g-1
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Indigowoad Leaf
Sichuan
397.6
153.6
Indigowoad Leaf
Anhui
421.5
863.9
Indigowoad Leaf
Anhui
384.0
164.8
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Indigowoad Leaf
Yunnan
957.4
1 117.7
Indigowoad Root
Anhui
17.5
18.5
Indigowoad Root
Hebei
14.6
24.2
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Indigowoad Root
Hebei
8.3
22.0
Indigowoad Root
Yunnan
5.7
7.5
Indigowoad Root
Guangdong
6.8
0
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Indigowoad Root
Jiangsu
8.5
18.3
Fig.1 Chromatogram of idigowoad root and leaves
A—Indigo；B—Medroxyprogeterone acetate;C—Indirubin
2.5 重复性实验
同时提取四川大青叶(样品1)粗粉4份，按上述方法制备样品液，色谱条件同上，测定，并计算出药材中二成份的含量.靛蓝
=397.4 μg/g,RSD=1.9%；靛玉红=149.7 μg/g，RSD=2.0%., http://www.100md.com
2.6 加样回收率测定
精密称取四川大青叶(样品1)粗粉4份，其中一份作为对照，另3份分别加入不同量的靛蓝、靛玉红对照液，按样品液方法操作，计算回收率，结果见表2.
Tab.2 Results of recovery tests Constit-
uentes
Added
/mg
Obs
/mg
Recovery
/%
, 百拇医药
Mean±SD
/%
Indigo
1.200
1.193
99.4
1.200
1.191
99.3
1.500
1.500
100.0
99.0±1.1
, 百拇医药
1.500
1.501
100.1
1.800
1.765
98.0
1.800
1.753
97.4
2.000
2.014
100.7
2.000
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2.009
100.5
Indirubin
2.400
2.460
102.5
104.2±3.5
2.400
2.571
107.1
2.800
3.050
, 百拇医药 109.0
2.800
2.951
105.4
3 讨论 作者试用联苯、萘、苯甲酸苯酯、安宫黄体酮等作为内标物，从分离度和保留时间上看，以安宫黄体酮为宜；避光条件下，24 h内板蓝根、大青叶中靛蓝、靛玉红在氯仿中稳定，时间过长，靛蓝、靛玉红分解，故应保证在24 h内完成实验；作者首次采用内标法，准确地测定了板蓝根、大青叶中靛蓝、靛玉红的含量，结果准确、可靠，重复性好.
参考文献
1 崔熙，李松林，王建新，等.南、北板蓝根的鉴别和氨基酸含量比较分析.中药材，1995，15(5)：17～19
2 乔传卓，崔熙.大青叶类药材的研究概况.中药材，1986，(5)：41
3 仲坚.板蓝根与大青叶在河北固安的生产代用情况与原植物辨别.中药通讯，1959,9(4)：15
4 杨军，王京霞.反相高效液相色谱法测定板蓝根、大青叶中靛蓝、靛玉红的含量.中药新药与临床药理，1996，7(2)：43～44
收稿日期:1999-10-08, 百拇医药
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